مروري بر كاربرد ميكروسكوپ نيروي اتمي در بيولوژي

مروري بر كاربرد ميكروسكوپ نيروي اتمي در بيولوژي
فرزانه مرعشي1،دکتر پیروز مرعشی2 ، سميه جليل‌زاده1

1- شرکت مهارفن ابزار

2- دانشگاه صنعتی امیرکبیر، دانشکده معدن، متالورژی و نفت

مقدمه

ميكروسكوپ نيروي اتمي (AFM) یکی از قدرتمندترین ابزارهاي تهيه تصوير توپوگرافی سطح بیومولکول‌ها در مقیاس زیر میکرومتر است.
برخلاف ميكروسكوپ ليزري روبشي هم‌كانون CLSM و میکروسکوپ الکترونی روبشي SEM، AFM نه تنها تحت شرایط فیزیولوژی بلکه در حین فرآيندهاي بیولوژی نيز قادر به تصویرسازی است [1].
به دليل نرمي و آسيب‌پذيري نمونه‌هاي بيولوژيكي، نمونه‌سازي نقش تعيين كننده‌ای دارد.
نمونه‌هاي AFM برخلاف CLSM نيازي به آغشتن نمونه به مواد فلوئورسنت يا مواد ديگر ندارند [2].
در تكنيك AFM، در مقايسه با SEM، نيازي به تثبيت فيزيكي يا شيميايي نمونه و اعمال پوشش ‌هادي بر روي سطح آن نيست.
بنابراين به عنوان مزاياي AFM، مي‌توان به توانايي تصويرگيري از سطوح غير هادي در محيط معمولی و زير سطح مايع اشاره نمود.
امروزه AFM براي تصوير گرفتن و بررسي ساختارهاي پروتئين، DNA، سلول‌‌هاي سرطاني، باكتري‌ها، ميكروب‌ها، ويروس‌ها،
پروتئين‌ها، برهم‌كنش‌هاي آنزيمي، ممبران‌ها، كروموزوم‌ها و ساختار بيومواد در شرايط فيزيولوژيكي مورد استفاده قرار مي‌‌گيرد.

1- اساس كار دستگاه:

تكنيك AFM، مانند انگشتان ما به هنگام لمس محیط عمل می‌کند. مغز انسان می‌تواند از لمس سطح شيء توسط يك انگشت، ‌توپوگرافی آن را استنتاج کند. قدرت تفکیک در این روش، به شعاع نوک انگشت بستگي دارد. در اين تكنيك برای دستیابی به قدرت تفکیک بالا، از يك سوزن تيز به طول حدود 2 ميكرون و غالبا قطر نوک كم‌تر از nm10 برای روبش نقطه به نقطه‌ي نمونه استفاده می‌شود (شکل1). در AFM، کامپیوتر نقش مغز را بازی می¬کند. در واقع‏، میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM)، سطح نمونه را توسط سوزن‏ حس مي‌كند. سوزن در انتهاي آزاد يك كانتي‌ليور ‌ به طول حدود 100 تا 450 ميكرون قرار دارد. نيروهاي بين سوزن و سطح نمونه باعث خم شدن يا انحراف كانتي‌ليور مي‌شوند. وقتی “سوزن” سطح نمونه را روبش مي‌كند يا نمونه در زير سوزن روبش مي‌شود (در سیستم‌هایی که نمونه حركت روبشي را انجام مي‌دهد)، ميزان انحراف كانتي‌ليور توسط يك آشکارساز اندازه‌گيري مي‌شود. اندازه‌گيري ميزان انحراف‌ كانتي‌ليور به كامپيوتر امكان توليد تصوير توپوگرافي سطح را مي‌دهد. مي‌توان از AFM براي مطالعه مواد هادي، نيمه‌هادي و عايق استفاده نمود. نیروهای مختلفی در انحراف كانتي‌ليور AFM مشاركت مي‌كنند. از جمله این نیروها می‌توان نيروهاي بين اتمي يا نيروهاي واندروالس را نام برد] 3[. شكل١ نحوه كار AFM را به صورت شماتيكي نشان مي‌دهد.

در خصوص نمونه‌هاي بيولوژيكي‏‏، براي دست‌يابي به كنتراست خوب و كاهش آسيب مكانيكي به نمونه، باید نمونه روی سطح تثبیت شود، به این معنا که مثلا با افزودن کاتیون مناسب، نمونه کاملا به سطح بچسبد. این تکنیک ساده، روزنه¬ای به جهان میکروسکوپی گشوده است و بشر را قادر ساخته تا عملكرد کوچک‌ترین اجزاي سازنده‌ي سیستم¬های بیولوژی را درک کند.

١- اساس کار AFM. الف) يك سوزن متصل به كانتي‌ليور (داراي خاصيت فنري) سطح را روبش مي‌كند. ب) انحراف كانتي‌ليور، از انعكاس يك پرتو ليزر روي آشكارساز نوري آشكارسازي مي‌شود. فرآيند تصويرگيري زیر سطح مايع نيز قابل انجام است. به اين ترتيب بيومولكول‌ها، هيدراته باقي مي‌مانند. پ) تصویر رگ مصنوعی با بزرگ‌نمایی 2000 برابر كه در آزمايشگاه شركت مهارفن‌ابزار تهيه شده است.
مي‌توان نمونه‌هاي بيولوژيكي را در مايعات بيولوژيكي مورد نياز براي نگهداري بافت‌ها و سلول‌ها مطالعه نمود. در بخش‌هاي بعد به نمونه‌هايي از كارهاي بي‌شمار انجام شده در اين زمينه مي‌پردازيم.

2- بيومواد

به كمك AFM مي‌توان سطح را پس از برهم‌كنش بيومواد با بافت زنده، آناليز نمود. به اين ترتيب، مشاهده زنگ‌زدگي‏، خوردگي يا تغييرات ديگر سطح (ناشي از برهم‌كنش بافت زنده) امكان‌پذير مي‌باشد. همچنين مولكول‌هاي جذب‌ شده (پروتئين‌ها، ليپيدها و آلودگي‌ها) روي سطح بيومواد (لنز، تيتانيوم و…) به وسيله‌ AFM قابل مشاهده هستند. از جمله تحقيقات انجام ‌شده در اين زمينه به‌كمك AFM، مي‌توان به بررسي‌ رابطه‌ زبري ايمپلنت با رشد پلاك ]4[، اندازه‌گيري ميزان چسبندگي ميكروب به بيومواد] 5[، ميزان برهم‌كنش باكتري و بيومواد] 6[ و چگونگي تشكيل لايه باكتري بر روي ايمپلنت دندان] 7[ اشاره نمود. امروزه استفاده از پليمرهايي كه به عنوان بيومواد استفاده مي‌شوند (مانند ايمپلنت‌هاي برون سلولي و لنزهاي طبي)، رشد سريعي در صنايع دارويي يافته‌اند.
افزايش چشمگير ساخت لنزهاي طبي سبب افزايش نياز به كنترل بهتر كيفيت و طراحي لنزهاي جديدتر شده است. توصيف ساختار و ويژگي‌هاي سطح، بخش بسيار مهمي در كنترل كيفيت ايفا مي‌كنند.

به عنوان نمونه، تعدادي از بررسي‌هاي انجام‌شده در اين زمينه به ‌كمك AFM، در زير ذكر شده‌اند] 5 و 8[:

• تصويرگيري در هوا و مايع بدون آسيب‌رساندن به لنز
• مشاهده آلودگي سطح
• مقايسه سطح لنز نو و مستعمل
• مشاهده سطح غشاي قرنيه
• مشاهده خراش سطح لنز
• مطالعه برهم‌كنش لنز و قرنيه
– انتقال باكتري از لنز به قرنيه
– تاثير قرنيه بر لنز: اندازه‌گيري ضريب يانگ

به منظور بهبود كارايي، كاهش سوزش و عفونت و افزايش مدت زمان استفاده، بايد فرآيند آلوده شدن لنز را بررسي نمود. شكل 2 جذب ليزوزيم (عمده پروتئين موجود در اشك چشم) به سطح لنز نو در طول زمان را نشان مي‌دهد] 5[.
شكل2- الف) لنز نو قبل از قرارگرفتن در محلول ليزوزيم، ب) بعد از 10 دقیقه، پ) بعد از 5 ساعت و ت) بعد از 48 ساعت

3- سلول

از آنجا كه تكنيك AFM از يك سنسور بسيار كوچك براي روبش سطح استفاده مي‌كند، شكل فيزيكي و خواص مكانيكي سطح بر تشكيل تصوير تاثير مي‌گذارد. اين تكنيك به‌خصوص براي مطالعه سطح غشاء، سطح سلول (شكل3) و اسكلت سلولي مناسب است] 9[. تصاوير به صورت سه‌بعدي در محيط كشت سلول و بدون نياز به تثبيت و رنگ‌شدن قابل دست‌يابي هستند. هم‌چنين AFM قادر به اندازه‌‌گيري مقدار نيرو مي‌باشد. به اين ترتيب مي‌توان برهم‌كنش بين سلول و سطح يا سلول‌ها با يكديگر را مطالعه نمود.
عمل تثبيت، عموما سبب سخت شدن سطح غشاي سلول مي‌شود. سخت شدن باعث مي‌شود تا تصوير سطح سلول تثبيت شده، بيش‌تر منعكس‌كننده‌ جزئيات سطح غشاء باشد تا اسكلت سلولي] 10[ (شكل4).

شكل3- تصوير سلول عضله جدا شده از نمونه انساني (جداسازي و كشت و تكثير سلول عضله انساني در سلول پیش ساز عضله )

4- دارو

امروزه، ميكروسكوپ نيروي اتمي كاربرد گسترده‌اي در تحقيقات داروئي يافته‌ است و مكمل بسيار خوبی براي تكنيك‌هاي معمول آناليز اين‌گونه مواد محسوب مي‌شود. از اين تكنيك مي‌توان در مطالعه‌ي روكش قرص‌ها، تعيين خواص ذرات، رشد كريستال و… بهره جست. تعدادي از تحقيقات انجام شده به‌كمك AFMدر اين زمينه عبارتند از:
• اندازه‌گيري چسبندگي حين توليد قرص] 11[
• ارزيابي زبري، سختي و تخلخل روكش قرص‌ها] 12[
• مطالعه‌ي تاثير پارامترهاي رشد كريستال (pH، غلظت، دما) بر تبلور] 12[
• اندازه‌گيري سرعت انحلال دارو] 13[

4-1 مقايسه انحلال صفحات كريستالی (001) و (100) آسپيرين

از AFM براي مقايسه انحلال كريستال‌هاي (001) و (100) آسپيرين استفاده شده است] 13[. در مطالعات انجام‌ شده روي انحلال، مشخص شده كه سرعت انحلال صفحه (100) 50% بيش از صفحه (001) است. تصاوير AFM، تاييد كننده اين مطلب هستند، زيرا سطحي نسبتا صاف از صفحه (001) و سطحي زبر براي صفحه (100) به نمايش مي‌گذارند (شكل 5). بنابراين صفحه (100) داراي سطح تماس بزرگ‌تر و در نتيجه سرعت انحلال بيش‌تري مي‌باشد.

4-2 مقايسه انحلال صفحات كريستالی (001) و (100) آسپيرين با استفاده از پروب پوشش‌دار

تحقيقات بيش‌تر روي اين سطوح با استفاده از پروب‌هاي پوشش‌دار انجام گرفته است (شكل 6). در اين روش از دو پروب استفاده شده است: پروب آب‌گريز (پوشش با گروه‌هاي CH3) و پروب آب‌دوست (پوشش با گروه‌هاي COOH). با اندازه‌گيري برهم‌كنش بين پروب‌ها با سطح دو صفحه، مشاهده شد كه بين پروب آب‌گريز و صفحه (001) و بين پروب آب‌دوست و صفحه (100) جاذبه‌ي قوي وجود دارد. بر اساس اين پژوهش مي‌توان نتيجه گرفت كه صفحه (100) با سهولت بیش‌تری، تر شده و سريع‌تر حل مي‌شود.

5- دندان

رشد و تكميل ميناي دندان انسان به‌ طور طبيعي تا چهار سال به طول مي‌انجامد. آيا انسان قادر است ميناي دندان را رشد دهد؟ براي پاسخ به اين سؤالات و سؤالات مشابه، تحقیقات بسياري به‌كمك AFM در اين زمينه انجام گرفته است. در اين آزمايشات AFM‏، به عنوان وسيله‌اي ضروري براي تحقيق بر روي اثر پارامترهاي مختلف بر رشد مصنوعي دندان شناخته شده است. از جمله كاربردهاي AFM در اين زمينه مي‌توان به موارد زير اشاره نمود:
• اندازه‌گيري زبري سطح سيم‌هاي ارتودنسي
• ارزيابي تاثير محيط و محلول‌هاي مختلف بر ساختار عاج دندان و فرسايش آن
• تعيين سختي و الاستیسیته اتصال عاج و ميناي دندان
• مطالعه عوامل مؤثر بر رشد ميناي دندان
در رشد ميناي دندان، عوامل زيادي مانند سلول‌ها، پروتئين‌ها و مواد معدني تاثیرگذار هستند. در اين بين، مهم‌ترين عوامل پروتئين آملوژنين و ماده معدني هيدروكسي‌آپاتيت مي‌باشند. در يكي از آزمايش‌هاي انجام شده كه در ادامه مي‌آيد، تاثير pH بر رشد اين دو عامل مورد بررسی قرار گرفته است] 16[. در اين آزمايش از كامپوزيت فلوئورآپاتيت (FAP) در شيشه به‌ عنوان زيرلايه استفاده شده است (شكل7).

در بررسي تاثير pH بر رشد آملوژنين، زيرلايه درون محلول كلسيم فسفات شامل آملوژنين قرار داده شد.
غلظت كلسيم فسفات مشابه شرايط رشد طبيعي دندان و دماي محيط C°37 انتخاب شده و فقط pH محلول تغيير داده شد. نتايج نشان داد كه با مقادير pH بين 6 تا 8، آملوژنين بر روي فلوئورآپاتيت و شيشه جذب مي‌شود و در 8/8= pH اثري از جذب ديده نمي‌شود (شكل8).

در شرايط مشابه در غياب آملوژنين، رشد هيدروكسي‌آپاتيت در مقادير مختلف pH بررسي شد. با افزايش pH، هيدروكسي‌آپاتيت در 8=pH شروع به هسته‌زايي همگن بر روي جزاير فلوئورآپاتيت و نه بر روي شيشه مي‌نمايد (شكل٩).

6- مغز انسان

از كاربردهاي AFM كه تاكنون در پژوهش‌هاي در رابطه با مغز انسان صورت پذيرفته، مي‌توان به تهيه تصاوير سه‌بعدي (شکل10)، تحقيق روي رشته‌هاي عصبي مغز] 17[ و نیز مشاهده مكانيزم رشد بتا آميلوئيد (Aß) اشاره نمود.

از آن‌جا كه AFM قادر است تصاوير توپوگرافي سه‌بعدي حاوي اطلاعاتي در حد نانومتر تهيه كند، وسيله‌اي مناسب براي ارزيابي ميزان تاثير آنتي‌بادي‌ها بر بيماري آلزايمر به ‌شمار مي‌رود. يكی از نشانه‌های اين بيماري، حضور پلاك‌هاي نامحلول در مغز مي‌باشد. اين پلاك‌ها از Aß ساخته شده‌اند. به كمك AFM تاثير دو آنتي‌بادي m3D6 و m266.2 بر تجمع Aß بررسي شده است.
همان‌طور كه در تصوير ملاحظه مي‌شود Aß به تنهايي رشته‌هاي بي‌شماري را ايجاد مي‌كند (شكل11الف). حضور m3D6 باعث مي‌شود رشته‌هاي كم‌تري تشكيل ‌شوند (شكل11ب). همچنين در حضور m266.2 هيچ رشته‌اي ايجاد نمي‌شود (شكل11پ) كه در تصوير سه‌بعدي AFM اين واقعيت به‌خوبي نمايش داده شده است.

7- موي انسان و تاثير مواد بر آن

توپوگرافی سطح مو یا سلول‌های لایه خارجی مو، تعیین کننده ظاهر مو می‌باشند، به علاوه می‌توان از آن‌ها در شناسایی بیماری‌ها و جرم‌شناسی استفاده نمود. میکروسکوپ نیروی اتمی به علت تصویرسازی با قدرت تفکیک بالا و سهولت آماده‌سازی نمونه، دارای مزایای منحصر به فردی در آنالیز سطح مو می‌باشد. به عنوان نمونه‌ای از کارهای انجام شده در این زمینه می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:
• مشاهده سطح ناصاف و پله ‌پله‌ مانند مو
• مطالعه خواص الكتروستاتيكي مو و تاثير مايع‌هاي مختلف بر آن
• مشاهده تاثير شامپو بر مو (تصوير 12)

يكي از آزمايشات انجام شده، بررسي اثر پلي‌كواترنيوم7‌ بر روي مو است. پلي‌كواترنيوم7‌ پليمري است كه در ساخت لوازم آرايشي به ‌طور گسترده‌ای استفاده مي‌شود. به‌كمك AFM تغييرات مورفولوژي رشته‌هاي مو بعد از كاربرد اين پليمر، قابل مشاهده است. استفاده مداوم از اين محصول سبب تجمع آن (‌‌ناشي از نيروهاي واندروالس‌) بر روي رشته‌هاي مو، بهتر شدن ظاهر مو و زبرتر شدن آن مي‌شود. پليمرهاي داراي كاتيون به ‌شدت در ساخت شامپو استفاده مي‌شوند. مي‌توان موي رنگ‌ شده را قبل و بعد از استفاده از محلول حاوي پلي‌كواترنيوم7‌ مقايسه نمود (شكل13).

با استفاده از نرم‌افزار AFM، مي‌توان

زبري سطح موي رنگ ‌شده را اندازه‌گيري نمود (جدول 1). نتايج نشان داد که سطح موي رنگ ‌شده پس از استفاده از محلول حاوي پلي‌كواترنيوم7‌، زبرتر است. افزايش زبري نشان‌دهنده جذب پليمر روي مو است. اين تغيير موجب كاهش بار ساكن، آسان‌تر شانه شدن، كاهش ساييدگي رشته‌هاي مو به‌ هم و در نتيجه افزايش لطافت مو مي‌شود.

جدول 1- نتايج به‌ دست آمده از اندازه‌گيري زبري به‌كمك نرم‌افزار دستگاه AFM. نتايج نشان مي‌دهند که زبري سطح موي رنگ‌شده پس از استفاده از polyquaternium 7® افزايش مي‌يابد.

زبري (RMS) nm فرآيند
16/0  54/2 polyquaternium 7® روي سطح شيشه
3/6 0/17 موي رنگ شده
0/7  5/27 موي رنگ ‌شده پس از استفاده از polyqaternium 7®

8- كروموزوم

تهيه تصاوير سه‌بعدي با قدرت تفكيك بالا از كروموزوم‌ها بدون نياز به رنگ و پوشش، به‌كمك AFM امكان‌پذير است (شكل14). يكي از قابليت‌ها در اين زمينه، آشكارسازي نابهنجاري ژنتيك سلولي مي‌باشد.
طبقه‌بندي كروموزوم‌ها با تعيين نسبت طول بازوها و تعیین ميزان تقارن بازوهاي كروموزوم (با توجه به موقعيت سانترومر ) انجام مي‌گيرد. با استفاده از نرم‌افزار AFM، به راحتي مي‌توان طول بازوها را اندازه‌گيري نمود] 23[. در حقیقت به‌كمك AFM ديگر نيازي به تكنيك‌هاي شيميايي رايج نيست و طبقه‌بندي تنها بر اساس تقارن صورت مي‌پذيرد. به این ترتیب می¬توان به ¬راحتی و بدون آسیب به کروموزوم، آن را شناسایی نموده و روی آن آزمایش انجام داد.

به عنوان برخي از كاربردهاي ديگر در اين زمينه، مي‌توان به موارد زير اشاره نمود:

• بررسي خواص ويسكوالاستيسيته
• تصويرسازي و آناليز ساختار
• طبقه‌بندي كروموزوم‌ها به كمك اندازه‌گيري حجم
• تحقيق وابستگي الاستیسیته به ميزان نمك موجود در محلول

9- كلاژن‌

از AFM در مشاهده و تعيين نوع كلاژن‌ها نيز استفاده مي‌شود. با استفاده از نرم‌افزار AFM مي‌توان قطر كلاژن‌ها را اندازه‌گيري نمود. نرم‌افزار AFM، در قسمت‌هايي كه توسط كاربر براي آن تعيين مي‌شود، پروفيلي از سطح ارائه مي‌دهد (شكل1٥). به كمك اين پروفيل و امكانات نرم‌افزاري سيستم، مي‌توان قطر كلاژن‌ و تناوب برجستگی‌ها را در سطح آن اندازه¬گیری نمود.

شكل1٥- الف) تصویری از فيبرهاي بلند كلاژن، خطوط خط‌چين و ممتد رسم شده توسط كاربر، ب) پروفیل طولی از سطح کلاژن که برجستگی‌های سطح را نشان می¬دهد (خط‌چين) و می¬توان به¬کمک این پروفیل، تناوب برجستگی‌ها در سطح کلاژن را اندازه-گیری نمود. پ) پروفیل عرضی(خط ممتد) كه با استفاده از آن قطر کلاژن اندازه¬گیری مي‌شود.

10- زيست مولكولي

به كمك منحني‌هاي نيرو- فاصله حاصل از تكنيك AFM، مي‌توان برهم‌كنش‌هاي بين مولكولي مطرح در علم زيست مولكولي را مورد بررسي قرار داد. از جمله نيروهاي حاصل از اين برهم‌كنش‌ها مي‌توان به نيروهاي بين دارو – گیرنده ، آنتي‌ژن – آنتي‌بادي و ليگاند – گيرنده اشاره نمود] 28[. اين منحني توسط نرم‌افزار سيستم رسم مي‌شود. براي اندازه‌گيري نيرو بين دو نوع مولكول‌، مي‌بايست يكي را روي سوزن و ديگري را روي سطح چسباند. با نزديك شدن آرام سوزن به سطح، برهم‌كنش دو نوع مولكول صورت مي‌پذيرد. سپس با بالا رفتن پروب، پيوندهاي ايجاد شده شكسته مي‌شوند. اين شكستن پيوند سبب ايجاد پرش در منحني نيرو – فاصله مي‌‌گردد.

به ‌عنوان مثال، برهم‌كنش بين LFA-1(گيرنده) و ICAM-1(ليگاند) در ادامه مورد بررسي قرار مي‌گیرد. همان‌طور كه در شكل1٦ نشان داده شده است، LFA-1 روي پروب و ICAM-1 در سطح قرار گرفته‌اند] 29[. در اين آزمايش، تركيبات مختلف (مانند يون منيزيم و پلي‌متيلن آكريلات PMA) به همراه ICAM-1 روي سطح قرار داده مي‌شوند تا تاثيرشان بر ميزان چسبندگي بررسي شود (شكل١٧).

همان‌طور كه اشاره شد

، پرش در منحني نيرو، نشان‌دهنده‌ شكستن يك يا چند پيوند است. با توجه به منحني‌هاي به دست آمده (نمودار 1) افزودن PMA، چسبندگي بيشتري نسبت به يون منيزيم ايجاد می‌کند، زیرا پرش‌هاي بيشتري در منحني مربوط به آن ديده مي‌شود، كه بيانگر تعداد پيوندهاي بيشتر بين LFA-1 و ICAM-1 مي‌باشد.

نتيجه‌گيري:

اين مقاله مروري، نتيجه بررسي بخشي از كاربردهاي گسترده AFM در مطالعه نمونه‌هاي بيولوژي مي‌باشد. ميكروسكوپ نيروي اتمي وسیله‌ای مناسب برای بررسی نمونه‌های بیولوژیکی زنده بدون نیاز به آماده‌سازی، تثبیت و از دست دادن شکل و خواص طبیعی نمونه می‌باشد. علاوه بر آن مي‌توان تاثير بيومولكول‌ها را بر روي بيومواد موجود در محيط‌هاي بيولوژي با استفاده از پارامترهاي ارائه شده از روش فوق، مورد بررسي قرار داد و در جهت ساخت بيومواد با كارايي بالا و عمر طولاني از آن استفاده نمود. همچنین به کمک این تکنیک می‌توان قدرت پیوند مولکول‌های مختلف، میزان الاستیسیته و چسبندگی سطوح و برهم‌کنش‌های مختلف انواع بيومولکول‌ها را مورد مطالعه قرار داد. از نتايج اين‌گونه مطالعات مي‌توان در بررسی اثر داروهای مختلف، سرعت انحلال آن‌ها و تشخیص بیماری‌ها استفاده نمود.