مروري بر كاربرد ميكروسكوپ نيروي اتمي در بيولوژي

مروری بر کاربرد میکروسکوپ نیروی اتمی در بیولوژی
فرزانه مرعشی1،دکتر پیروز مرعشی2 ، سمیه جلیل‌زاده1

1- شرکت مهارفن ابزار

2- دانشگاه صنعتی امیرکبیر، دانشکده معدن، متالورژی و نفت

مقدمه

میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) یکی از قدرتمندترین ابزارهای تهیه تصویر توپوگرافی سطح بیومولکول‌ها در مقیاس زیر میکرومتر است.
برخلاف میکروسکوپ لیزری روبشی هم‌کانون CLSM و میکروسکوپ الکترونی روبشی SEM، AFM نه تنها تحت شرایط فیزیولوژی بلکه در حین فرآیندهای بیولوژی نیز قادر به تصویرسازی است [1].
به دلیل نرمی و آسیب‌پذیری نمونه‌های بیولوژیکی، نمونه‌سازی نقش تعیین کننده‌ای دارد.
نمونه‌های AFM برخلاف CLSM نیازی به آغشتن نمونه به مواد فلوئورسنت یا مواد دیگر ندارند [2].
در تکنیک AFM، در مقایسه با SEM، نیازی به تثبیت فیزیکی یا شیمیایی نمونه و اعمال پوشش ‌هادی بر روی سطح آن نیست.
بنابراین به عنوان مزایای AFM، می‌توان به توانایی تصویرگیری از سطوح غیر هادی در محیط معمولی و زیر سطح مایع اشاره نمود.
امروزه AFM برای تصویر گرفتن و بررسی ساختارهای پروتئین، DNA، سلول‌‌های سرطانی، باکتری‌ها، میکروب‌ها، ویروس‌ها،
پروتئین‌ها، برهم‌کنش‌های آنزیمی، ممبران‌ها، کروموزوم‌ها و ساختار بیومواد در شرایط فیزیولوژیکی مورد استفاده قرار می‌‌گیرد.

1- اساس کار دستگاه:

تکنیک AFM، مانند انگشتان ما به هنگام لمس محیط عمل می‌کند. مغز انسان می‌تواند از لمس سطح شیء توسط یک انگشت، ‌توپوگرافی آن را استنتاج کند. قدرت تفکیک در این روش، به شعاع نوک انگشت بستگی دارد. در این تکنیک برای دستیابی به قدرت تفکیک بالا، از یک سوزن تیز به طول حدود 2 میکرون و غالبا قطر نوک کم‌تر از nm10 برای روبش نقطه به نقطه‌ی نمونه استفاده می‌شود (شکل1). در AFM، کامپیوتر نقش مغز را بازی می¬کند. در واقع‏، میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM)، سطح نمونه را توسط سوزن‏ حس می‌کند. سوزن در انتهای آزاد یک کانتی‌لیور ‌ به طول حدود 100 تا 450 میکرون قرار دارد. نیروهای بین سوزن و سطح نمونه باعث خم شدن یا انحراف کانتی‌لیور می‌شوند. وقتی “سوزن” سطح نمونه را روبش می‌کند یا نمونه در زیر سوزن روبش می‌شود (در سیستم‌هایی که نمونه حرکت روبشی را انجام می‌دهد)، میزان انحراف کانتی‌لیور توسط یک آشکارساز اندازه‌گیری می‌شود. اندازه‌گیری میزان انحراف‌ کانتی‌لیور به کامپیوتر امکان تولید تصویر توپوگرافی سطح را می‌دهد. می‌توان از AFM برای مطالعه مواد هادی، نیمه‌هادی و عایق استفاده نمود. نیروهای مختلفی در انحراف کانتی‌لیور AFM مشارکت می‌کنند. از جمله این نیروها می‌توان نیروهای بین اتمی یا نیروهای واندروالس را نام برد] 3[. شکل١ نحوه کار AFM را به صورت شماتیکی نشان می‌دهد.

در خصوص نمونه‌های بیولوژیکی‏‏، برای دست‌یابی به کنتراست خوب و کاهش آسیب مکانیکی به نمونه، باید نمونه روی سطح تثبیت شود، به این معنا که مثلا با افزودن کاتیون مناسب، نمونه کاملا به سطح بچسبد. این تکنیک ساده، روزنه¬ای به جهان میکروسکوپی گشوده است و بشر را قادر ساخته تا عملکرد کوچک‌ترین اجزای سازنده‌ی سیستم¬های بیولوژی را درک کند.

١- اساس کار AFM. الف) یک سوزن متصل به کانتی‌لیور (دارای خاصیت فنری) سطح را روبش می‌کند. ب) انحراف کانتی‌لیور، از انعکاس یک پرتو لیزر روی آشکارساز نوری آشکارسازی می‌شود. فرآیند تصویرگیری زیر سطح مایع نیز قابل انجام است. به این ترتیب بیومولکول‌ها، هیدراته باقی می‌مانند. پ) تصویر رگ مصنوعی با بزرگ‌نمایی 2000 برابر که در آزمایشگاه شرکت مهارفن‌ابزار تهیه شده است.
می‌توان نمونه‌های بیولوژیکی را در مایعات بیولوژیکی مورد نیاز برای نگهداری بافت‌ها و سلول‌ها مطالعه نمود. در بخش‌های بعد به نمونه‌هایی از کارهای بی‌شمار انجام شده در این زمینه می‌پردازیم.

2- بیومواد

به کمک AFM می‌توان سطح را پس از برهم‌کنش بیومواد با بافت زنده، آنالیز نمود. به این ترتیب، مشاهده زنگ‌زدگی‏، خوردگی یا تغییرات دیگر سطح (ناشی از برهم‌کنش بافت زنده) امکان‌پذیر می‌باشد. همچنین مولکول‌های جذب‌ شده (پروتئین‌ها، لیپیدها و آلودگی‌ها) روی سطح بیومواد (لنز، تیتانیوم و…) به وسیله‌ AFM قابل مشاهده هستند. از جمله تحقیقات انجام ‌شده در این زمینه به‌کمک AFM، می‌توان به بررسی‌ رابطه‌ زبری ایمپلنت با رشد پلاک ]4[، اندازه‌گیری میزان چسبندگی میکروب به بیومواد] 5[، میزان برهم‌کنش باکتری و بیومواد] 6[ و چگونگی تشکیل لایه باکتری بر روی ایمپلنت دندان] 7[ اشاره نمود. امروزه استفاده از پلیمرهایی که به عنوان بیومواد استفاده می‌شوند (مانند ایمپلنت‌های برون سلولی و لنزهای طبی)، رشد سریعی در صنایع دارویی یافته‌اند.
افزایش چشمگیر ساخت لنزهای طبی سبب افزایش نیاز به کنترل بهتر کیفیت و طراحی لنزهای جدیدتر شده است. توصیف ساختار و ویژگی‌های سطح، بخش بسیار مهمی در کنترل کیفیت ایفا می‌کنند.

به عنوان نمونه، تعدادی از بررسی‌های انجام‌شده در این زمینه به ‌کمک AFM، در زیر ذکر شده‌اند] 5 و 8[:

• تصویرگیری در هوا و مایع بدون آسیب‌رساندن به لنز
• مشاهده آلودگی سطح
• مقایسه سطح لنز نو و مستعمل
• مشاهده سطح غشای قرنیه
• مشاهده خراش سطح لنز
• مطالعه برهم‌کنش لنز و قرنیه
– انتقال باکتری از لنز به قرنیه
– تاثیر قرنیه بر لنز: اندازه‌گیری ضریب یانگ

به منظور بهبود کارایی، کاهش سوزش و عفونت و افزایش مدت زمان استفاده، باید فرآیند آلوده شدن لنز را بررسی نمود. شکل 2 جذب لیزوزیم (عمده پروتئین موجود در اشک چشم) به سطح لنز نو در طول زمان را نشان می‌دهد] 5[.
شکل2- الف) لنز نو قبل از قرارگرفتن در محلول لیزوزیم، ب) بعد از 10 دقیقه، پ) بعد از 5 ساعت و ت) بعد از 48 ساعت

3- سلول

از آنجا که تکنیک AFM از یک سنسور بسیار کوچک برای روبش سطح استفاده می‌کند، شکل فیزیکی و خواص مکانیکی سطح بر تشکیل تصویر تاثیر می‌گذارد. این تکنیک به‌خصوص برای مطالعه سطح غشاء، سطح سلول (شکل3) و اسکلت سلولی مناسب است] 9[. تصاویر به صورت سه‌بعدی در محیط کشت سلول و بدون نیاز به تثبیت و رنگ‌شدن قابل دست‌یابی هستند. هم‌چنین AFM قادر به اندازه‌‌گیری مقدار نیرو می‌باشد. به این ترتیب می‌توان برهم‌کنش بین سلول و سطح یا سلول‌ها با یکدیگر را مطالعه نمود.
عمل تثبیت، عموما سبب سخت شدن سطح غشای سلول می‌شود. سخت شدن باعث می‌شود تا تصویر سطح سلول تثبیت شده، بیش‌تر منعکس‌کننده‌ جزئیات سطح غشاء باشد تا اسکلت سلولی] 10[ (شکل4).

شکل3- تصویر سلول عضله جدا شده از نمونه انسانی (جداسازی و کشت و تکثیر سلول عضله انسانی در سلول پیش ساز عضله )

4- دارو

امروزه، میکروسکوپ نیروی اتمی کاربرد گسترده‌ای در تحقیقات داروئی یافته‌ است و مکمل بسیار خوبی برای تکنیک‌های معمول آنالیز این‌گونه مواد محسوب می‌شود. از این تکنیک می‌توان در مطالعه‌ی روکش قرص‌ها، تعیین خواص ذرات، رشد کریستال و… بهره جست. تعدادی از تحقیقات انجام شده به‌کمک AFMدر این زمینه عبارتند از:
• اندازه‌گیری چسبندگی حین تولید قرص] 11[
• ارزیابی زبری، سختی و تخلخل روکش قرص‌ها] 12[
• مطالعه‌ی تاثیر پارامترهای رشد کریستال (pH، غلظت، دما) بر تبلور] 12[
• اندازه‌گیری سرعت انحلال دارو] 13[

4-1 مقایسه انحلال صفحات کریستالی (001) و (100) آسپیرین

از AFM برای مقایسه انحلال کریستال‌های (001) و (100) آسپیرین استفاده شده است] 13[. در مطالعات انجام‌ شده روی انحلال، مشخص شده که سرعت انحلال صفحه (100) 50% بیش از صفحه (001) است. تصاویر AFM، تایید کننده این مطلب هستند، زیرا سطحی نسبتا صاف از صفحه (001) و سطحی زبر برای صفحه (100) به نمایش می‌گذارند (شکل 5). بنابراین صفحه (100) دارای سطح تماس بزرگ‌تر و در نتیجه سرعت انحلال بیش‌تری می‌باشد.

4-2 مقایسه انحلال صفحات کریستالی (001) و (100) آسپیرین با استفاده از پروب پوشش‌دار

تحقیقات بیش‌تر روی این سطوح با استفاده از پروب‌های پوشش‌دار انجام گرفته است (شکل 6). در این روش از دو پروب استفاده شده است: پروب آب‌گریز (پوشش با گروه‌های CH3) و پروب آب‌دوست (پوشش با گروه‌های COOH). با اندازه‌گیری برهم‌کنش بین پروب‌ها با سطح دو صفحه، مشاهده شد که بین پروب آب‌گریز و صفحه (001) و بین پروب آب‌دوست و صفحه (100) جاذبه‌ی قوی وجود دارد. بر اساس این پژوهش می‌توان نتیجه گرفت که صفحه (100) با سهولت بیش‌تری، تر شده و سریع‌تر حل می‌شود.

5- دندان

رشد و تکمیل مینای دندان انسان به‌ طور طبیعی تا چهار سال به طول می‌انجامد. آیا انسان قادر است مینای دندان را رشد دهد؟ برای پاسخ به این سؤالات و سؤالات مشابه، تحقیقات بسیاری به‌کمک AFM در این زمینه انجام گرفته است. در این آزمایشات AFM‏، به عنوان وسیله‌ای ضروری برای تحقیق بر روی اثر پارامترهای مختلف بر رشد مصنوعی دندان شناخته شده است. از جمله کاربردهای AFM در این زمینه می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:
• اندازه‌گیری زبری سطح سیم‌های ارتودنسی
• ارزیابی تاثیر محیط و محلول‌های مختلف بر ساختار عاج دندان و فرسایش آن
• تعیین سختی و الاستیسیته اتصال عاج و مینای دندان
• مطالعه عوامل مؤثر بر رشد مینای دندان
در رشد مینای دندان، عوامل زیادی مانند سلول‌ها، پروتئین‌ها و مواد معدنی تاثیرگذار هستند. در این بین، مهم‌ترین عوامل پروتئین آملوژنین و ماده معدنی هیدروکسی‌آپاتیت می‌باشند. در یکی از آزمایش‌های انجام شده که در ادامه می‌آید، تاثیر pH بر رشد این دو عامل مورد بررسی قرار گرفته است] 16[. در این آزمایش از کامپوزیت فلوئورآپاتیت (FAP) در شیشه به‌ عنوان زیرلایه استفاده شده است (شکل7).

در بررسی تاثیر pH بر رشد آملوژنین، زیرلایه درون محلول کلسیم فسفات شامل آملوژنین قرار داده شد.
غلظت کلسیم فسفات مشابه شرایط رشد طبیعی دندان و دمای محیط C°37 انتخاب شده و فقط pH محلول تغییر داده شد. نتایج نشان داد که با مقادیر pH بین 6 تا 8، آملوژنین بر روی فلوئورآپاتیت و شیشه جذب می‌شود و در 8/8= pH اثری از جذب دیده نمی‌شود (شکل8).

در شرایط مشابه در غیاب آملوژنین، رشد هیدروکسی‌آپاتیت در مقادیر مختلف pH بررسی شد. با افزایش pH، هیدروکسی‌آپاتیت در 8=pH شروع به هسته‌زایی همگن بر روی جزایر فلوئورآپاتیت و نه بر روی شیشه می‌نماید (شکل٩).

6- مغز انسان

از کاربردهای AFM که تاکنون در پژوهش‌های در رابطه با مغز انسان صورت پذیرفته، می‌توان به تهیه تصاویر سه‌بعدی (شکل10)، تحقیق روی رشته‌های عصبی مغز] 17[ و نیز مشاهده مکانیزم رشد بتا آمیلوئید (Aß) اشاره نمود.

از آن‌جا که AFM قادر است تصاویر توپوگرافی سه‌بعدی حاوی اطلاعاتی در حد نانومتر تهیه کند، وسیله‌ای مناسب برای ارزیابی میزان تاثیر آنتی‌بادی‌ها بر بیماری آلزایمر به ‌شمار می‌رود. یکی از نشانه‌های این بیماری، حضور پلاک‌های نامحلول در مغز می‌باشد. این پلاک‌ها از Aß ساخته شده‌اند. به کمک AFM تاثیر دو آنتی‌بادی m3D6 و m266.2 بر تجمع Aß بررسی شده است.
همان‌طور که در تصویر ملاحظه می‌شود Aß به تنهایی رشته‌های بی‌شماری را ایجاد می‌کند (شکل11الف). حضور m3D6 باعث می‌شود رشته‌های کم‌تری تشکیل ‌شوند (شکل11ب). همچنین در حضور m266.2 هیچ رشته‌ای ایجاد نمی‌شود (شکل11پ) که در تصویر سه‌بعدی AFM این واقعیت به‌خوبی نمایش داده شده است.

7- موی انسان و تاثیر مواد بر آن

توپوگرافی سطح مو یا سلول‌های لایه خارجی مو، تعیین کننده ظاهر مو می‌باشند، به علاوه می‌توان از آن‌ها در شناسایی بیماری‌ها و جرم‌شناسی استفاده نمود. میکروسکوپ نیروی اتمی به علت تصویرسازی با قدرت تفکیک بالا و سهولت آماده‌سازی نمونه، دارای مزایای منحصر به فردی در آنالیز سطح مو می‌باشد. به عنوان نمونه‌ای از کارهای انجام شده در این زمینه می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:
• مشاهده سطح ناصاف و پله ‌پله‌ مانند مو
• مطالعه خواص الکتروستاتیکی مو و تاثیر مایع‌های مختلف بر آن
• مشاهده تاثیر شامپو بر مو (تصویر 12)

یکی از آزمایشات انجام شده، بررسی اثر پلی‌کواترنیوم7‌ بر روی مو است. پلی‌کواترنیوم7‌ پلیمری است که در ساخت لوازم آرایشی به ‌طور گسترده‌ای استفاده می‌شود. به‌کمک AFM تغییرات مورفولوژی رشته‌های مو بعد از کاربرد این پلیمر، قابل مشاهده است. استفاده مداوم از این محصول سبب تجمع آن (‌‌ناشی از نیروهای واندروالس‌) بر روی رشته‌های مو، بهتر شدن ظاهر مو و زبرتر شدن آن می‌شود. پلیمرهای دارای کاتیون به ‌شدت در ساخت شامپو استفاده می‌شوند. می‌توان موی رنگ‌ شده را قبل و بعد از استفاده از محلول حاوی پلی‌کواترنیوم7‌ مقایسه نمود (شکل13).

با استفاده از نرم‌افزار AFM، می‌توان

زبری سطح موی رنگ ‌شده را اندازه‌گیری نمود (جدول 1). نتایج نشان داد که سطح موی رنگ ‌شده پس از استفاده از محلول حاوی پلی‌کواترنیوم7‌، زبرتر است. افزایش زبری نشان‌دهنده جذب پلیمر روی مو است. این تغییر موجب کاهش بار ساکن، آسان‌تر شانه شدن، کاهش ساییدگی رشته‌های مو به‌ هم و در نتیجه افزایش لطافت مو می‌شود.

جدول 1- نتایج به‌ دست آمده از اندازه‌گیری زبری به‌کمک نرم‌افزار دستگاه AFM. نتایج نشان می‌دهند که زبری سطح موی رنگ‌شده پس از استفاده از polyquaternium 7® افزایش می‌یابد.

زبری (RMS) nm فرآیند
16/0  54/2 polyquaternium 7® روی سطح شیشه
3/6 0/17 موی رنگ شده
0/7  5/27 موی رنگ ‌شده پس از استفاده از polyqaternium 7®

8- کروموزوم

تهیه تصاویر سه‌بعدی با قدرت تفکیک بالا از کروموزوم‌ها بدون نیاز به رنگ و پوشش، به‌کمک AFM امکان‌پذیر است (شکل14). یکی از قابلیت‌ها در این زمینه، آشکارسازی نابهنجاری ژنتیک سلولی می‌باشد.
طبقه‌بندی کروموزوم‌ها با تعیین نسبت طول بازوها و تعیین میزان تقارن بازوهای کروموزوم (با توجه به موقعیت سانترومر ) انجام می‌گیرد. با استفاده از نرم‌افزار AFM، به راحتی می‌توان طول بازوها را اندازه‌گیری نمود] 23[. در حقیقت به‌کمک AFM دیگر نیازی به تکنیک‌های شیمیایی رایج نیست و طبقه‌بندی تنها بر اساس تقارن صورت می‌پذیرد. به این ترتیب می¬توان به ¬راحتی و بدون آسیب به کروموزوم، آن را شناسایی نموده و روی آن آزمایش انجام داد.

به عنوان برخی از کاربردهای دیگر در این زمینه، می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:

• بررسی خواص ویسکوالاستیسیته
• تصویرسازی و آنالیز ساختار
• طبقه‌بندی کروموزوم‌ها به کمک اندازه‌گیری حجم
• تحقیق وابستگی الاستیسیته به میزان نمک موجود در محلول

9- کلاژن‌

از AFM در مشاهده و تعیین نوع کلاژن‌ها نیز استفاده می‌شود. با استفاده از نرم‌افزار AFM می‌توان قطر کلاژن‌ها را اندازه‌گیری نمود. نرم‌افزار AFM، در قسمت‌هایی که توسط کاربر برای آن تعیین می‌شود، پروفیلی از سطح ارائه می‌دهد (شکل1۵). به کمک این پروفیل و امکانات نرم‌افزاری سیستم، می‌توان قطر کلاژن‌ و تناوب برجستگی‌ها را در سطح آن اندازه¬گیری نمود.

شکل1۵- الف) تصویری از فیبرهای بلند کلاژن، خطوط خط‌چین و ممتد رسم شده توسط کاربر، ب) پروفیل طولی از سطح کلاژن که برجستگی‌های سطح را نشان می¬دهد (خط‌چین) و می¬توان به¬کمک این پروفیل، تناوب برجستگی‌ها در سطح کلاژن را اندازه-گیری نمود. پ) پروفیل عرضی(خط ممتد) که با استفاده از آن قطر کلاژن اندازه¬گیری می‌شود.

10- زیست مولکولی

به کمک منحنی‌های نیرو- فاصله حاصل از تکنیک AFM، می‌توان برهم‌کنش‌های بین مولکولی مطرح در علم زیست مولکولی را مورد بررسی قرار داد. از جمله نیروهای حاصل از این برهم‌کنش‌ها می‌توان به نیروهای بین دارو – گیرنده ، آنتی‌ژن – آنتی‌بادی و لیگاند – گیرنده اشاره نمود] 28[. این منحنی توسط نرم‌افزار سیستم رسم می‌شود. برای اندازه‌گیری نیرو بین دو نوع مولکول‌، می‌بایست یکی را روی سوزن و دیگری را روی سطح چسباند. با نزدیک شدن آرام سوزن به سطح، برهم‌کنش دو نوع مولکول صورت می‌پذیرد. سپس با بالا رفتن پروب، پیوندهای ایجاد شده شکسته می‌شوند. این شکستن پیوند سبب ایجاد پرش در منحنی نیرو – فاصله می‌‌گردد.

به ‌عنوان مثال، برهم‌کنش بین LFA-1(گیرنده) و ICAM-1(لیگاند) در ادامه مورد بررسی قرار می‌گیرد. همان‌طور که در شکل1۶ نشان داده شده است، LFA-1 روی پروب و ICAM-1 در سطح قرار گرفته‌اند] 29[. در این آزمایش، ترکیبات مختلف (مانند یون منیزیم و پلی‌متیلن آکریلات PMA) به همراه ICAM-1 روی سطح قرار داده می‌شوند تا تاثیرشان بر میزان چسبندگی بررسی شود (شکل١٧).

همان‌طور که اشاره شد

، پرش در منحنی نیرو، نشان‌دهنده‌ شکستن یک یا چند پیوند است. با توجه به منحنی‌های به دست آمده (نمودار 1) افزودن PMA، چسبندگی بیشتری نسبت به یون منیزیم ایجاد می‌کند، زیرا پرش‌های بیشتری در منحنی مربوط به آن دیده می‌شود، که بیانگر تعداد پیوندهای بیشتر بین LFA-1 و ICAM-1 می‌باشد.

نتیجه‌گیری:

این مقاله مروری، نتیجه بررسی بخشی از کاربردهای گسترده AFM در مطالعه نمونه‌های بیولوژی می‌باشد. میکروسکوپ نیروی اتمی وسیله‌ای مناسب برای بررسی نمونه‌های بیولوژیکی زنده بدون نیاز به آماده‌سازی، تثبیت و از دست دادن شکل و خواص طبیعی نمونه می‌باشد. علاوه بر آن می‌توان تاثیر بیومولکول‌ها را بر روی بیومواد موجود در محیط‌های بیولوژی با استفاده از پارامترهای ارائه شده از روش فوق، مورد بررسی قرار داد و در جهت ساخت بیومواد با کارایی بالا و عمر طولانی از آن استفاده نمود. همچنین به کمک این تکنیک می‌توان قدرت پیوند مولکول‌های مختلف، میزان الاستیسیته و چسبندگی سطوح و برهم‌کنش‌های مختلف انواع بیومولکول‌ها را مورد مطالعه قرار داد. از نتایج این‌گونه مطالعات می‌توان در بررسی اثر داروهای مختلف، سرعت انحلال آن‌ها و تشخیص بیماری‌ها استفاده نمود.